分子生物学实验技术—凝胶电泳、成像篇

上海飒凌电子 2020-5-15

琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳主要区别是:它兼有"分子筛"和"电泳"的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，分子通过时会受到阻力，大分子物质受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。

DNA 在碱性条件下（缓冲液pH8.0）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA   篇段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。核酸染料可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带。

哪些因素会影响DNA分子的迁移速率呢？

DNA 的分子大小

 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA篇段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%，DNA篇段大小介于两者间所需胶浓度为0.8-1.0%。

DNA分子构象

DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动很快，而开环双链DNA移动慢。

 电源电压

在低电压时，线状DNA篇段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA篇段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA篇段有效分离所加电压不得超过5V/cm。

嵌入染料的存在

染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低。

离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。

因此，在实际电泳过程中需要充分考虑以上几种因素，选择合适的电泳条件，从而达到理想的实验结果。

凝胶电泳过程中所用到的实验器具及试剂主要有：

水平电泳仪，恒温水浴锅/微波炉，移液器，缓冲液，琼脂糖，核酸染料，DNA Ladders

实验步骤：

1. 安装电泳槽，准备制胶

根据实验需求及目的，选择合适的制胶板及梳子。

2. 制备琼脂糖凝胶

根据DNA的篇段大小，选择琼脂糖溶解在电泳缓冲液中的比例。称取琼脂糖置于缓冲液中，选择水浴锅或者微波炉加热至*溶解，并摇匀。

3. 灌胶

     将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。

4. 待琼脂糖凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，拔出梳子。

5. 加样

       将DNA样品与加样缓冲液按比例混匀后，用移液器加到样品槽中。

6. 电泳

     安装好电极导线，打开电源，调节电压3-5V/cm，当溴酚蓝到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。

7. 染色和观察

       取出凝胶，放进含有核酸染料的稀释液中（按说明书要求稀释，或者在制胶过程中加到凝胶内）染色，在紫外或者蓝光灯下观察。

在实验过程中需要注意一下内容：

（1）凝胶成像系统的选择：成像产品主要可以分为蓝光系统和紫外系统。

蓝光切胶仪的光源为蓝光，发射波长为470nm，对实验人员及样品的损害较小。适用于一些安全染料，如：SYBR Safe、SYBR Green I 等。

紫外光源适用于所有染料，254nm、365nm、312nm 三种不同的波长可选择。

（2）DNA Ladders 的选择：所扩增的片段应在DNA Ladders的指示范围内，否则无法起到指示作用。